gostyń endokrynolog

Doprowadziło to do fenotypów zależnych od dawki i patologii zależnych od REEP1, bardzo podobnych do tych obserwowanych u pacjentów z HSP. Na poziomie subkomórkowym obserwowaliśmy zmniejszoną złożoność obwodowego ER w korowych neuronach ruchowych. Wraz z dowodami in vitro na REEP1 w indukcji pozytywnej krzywizny błony, nasze badanie łączy upośledzone kształtowanie ER z niepowodzeniem w utrzymywaniu długich aksonów. Wyniki Brak egzonu 2 REEP1 jest związany z fenotypem paraplegii spastycznej u ludzi i myszy. Podczas przesiewowego badania pacjentów z HSP pod kątem mutacji w REEP1, multipleksowana zależna od ligacji amplifikacja sond (MLPA) sugerowała heterozygotyczną nieobecność egzonu 2 u pacjenta z wywiadem rodzinnym o czystej, wczesnej postaci choroby (Figura 1A). Daleki zakres PCR ujawnił, że ekson 2 plus flankujące sekwencje intronowe są usuwane i zasugerowano niehomologiczne przyłączanie końców sąsiednich pęknięć dwuniciowych jako mechanizm mutacji (Figura 1B). Przewiduje się, że brak eksonu 2 w mRNA REEP1 tworzy przedterminalny kodon stop w eksonie 3 (Suplementowa Figura 1, materiał uzupełniający dostępny online w tym artykule; doi: 10.1172 / JCI65665DS1). Figura Brak egzonu 2 REEP1 jest związany z paraplegią spastyczną u ludzi i powoduje ciężki fenotyp ruchowy u myszy. (A) Badanie przesiewowe genomowego DNA oparte na MLPA od pacjenta z indeksem HSP w celu zmiany liczby kopii w REEP1. Test ma na celu egzony 3. 6 z pojedynczymi sondami i eksonami 1, 2 i 7 z 2 lub 3 sondami (ex1-1, ex1-2, itd.). Względne sygnały MLPA o wartości około 1,0 wskazują normalną diploidalną liczbę kopii (szare słupki), podczas gdy sygnały o wartości około 0,5 (czarne słupki) wskazują na heterozygotyczną delecję genomową. (B) Wyrównanie sekwencji intron REEP1 i intron 2 z sekwencją allelu fuzyjnego. Pole to podkreśla mikrohomologię 3 pz na połączeniu, a wykrzykniki oznaczają tożsamość nukleotydową. (C) Strategia delecji Reep1 ekson 2 u myszy. Locus typu dzikiego (górny schemat); gruba linia pozioma oznacza region genomowy użyty w konstrukcji kierującej. Docelowe locus jest pokazane na schemacie środkowym, a docelowe locus po eksonowaniu 2 za pośrednictwem Cre pokazano w dolnym schemacie. Ponumerowane czarne kwadraty: eksony; trójkąty: loxP sites; NEO: kaseta selekcji neomycyny; BamHI, EcoRI, Smal, SalI: miejsca restrykcyjne stosowane do klonowania. (D) Analiza Western blot lizatów mózgu z Reep1 + / + i Reep1. /. myszy z zastosowaniem oczyszczonych przez powinowactwo przeciwciał anty-REEP1 wykazują brak białka REEP1 w Reepl . /. myszy. (E) Szesnastomiesięczny Reep1. /. myszy cierpią na zaburzenia chodu (patrz także Uzupełniające wideo i 2). Zwróć uwagę na szerokie pozycjonowanie kończyn tylnych, postawę kifotyczną oraz to, że ani ciało tylne, ani ogon nie są prawidłowo uniesione. W celu zbadania patofizjologii HSP związanego z REEP1, modelowaliśmy delecję eksonów 2 u myszy (Figura 1C i Suplementowa Figura 1). Efekty na poziomie białka badano za pomocą przeciwciała otrzymanego z immunizacji królików przeciwko C-końcowemu epitopowi REEP1 (dodatkowa Figura 2). Podczas gdy prążek o odpowiedniej wielkości został rozpoznany w lizatach mózgu myszy typu dzikiego (Reep1 + / +), immunoreaktywność anty-REEP1 była nieobecna u myszy homozygotycznych pod względem delecji Reep1 ekson 2 (Reep1 A / P). To odkrycie potwierdziło specyficzność przeciwciała, ujawniło brak REEP1 po delecji egzonu 2 i scharakteryzowało mutację jako reprezentującą allel nokautujący (Figura 1D). Łączenie się heterozygotycznych myszy (Reep1 + / a) spowodowało potomstwo wszystkich trzech genotypów w stosunku Mendeliana. Podczas gdy młody Reep1 + /. i Reep1. /. myszy nie można było odróżnić od myszy Reep1 + / + za pomocą oględzin, kończyn tylnych Reep1. /. myszy starsze niż 12 miesięcy zostały nieprawidłowo uprowadzone podczas poruszania się, z ekstremalnym obrotem zewnętrznym łap
[hasła pokrewne: rezonans magnetyczny kraków cena, rak tarczycy objawy, przetoka zębowa ]