W celu dostarczenia wirusa, .l wirusa wstrzyknięto stereotaktycznie w śródczaszkowym VN we współrzędnych (środkowo-boczne [ML] = a 1,25, anterioposterior [AP] = 6,00, dorsoventral [DV] => 3,90) z bregmy. Wirusy wstrzykiwano obustronnie, a zwierzęta odzyskiwano przez 2 tygodnie przed testami behawioralnymi. MRI. Myszy znieczulono 1,5% izofluranem i utrzymywano w 37 ° C podczas eksperymentu z wymuszonym ogrzanym powietrzem i na poduszce rozgrzewającej. Podczas sesji MRI mysz była zamontowana w cewce tak, że sygnał był skupiony na obszarze głowy. Mysz trzymano w pozycji z kilkoma kawałkami taśmy klejącej. Przybliżone parametry były następujące: parametry typu echa spinowego 3000/40 ms opóźnienie cyklu / czas echa, 2-średnie, 12-minutowy czas akwizycji. Po obrazowaniu myszy monitorowano, aby zapewnić całkowite wyleczenie przed powrotem do klatki. Pulsymetria i oksymetria za pomocą spektroskopii optycznej. Włosy w okolicy szyi myszy usunięto kremem depilującym Nair, stosując 5-minutową aplikację; krem został następnie dokładnie usunięty wilgotnym ręcznikiem papierowym. Co najmniej 24 godziny później zmierzono nasycenie tlenem, częstość oddechów i częstość akcji serca za pomocą spektroskopii optycznej i oprogramowania spektroskopii MouseOx (Starr Life Sciences). Po 5 minutach aklimatyzacji, aby powściągnąć ją ręcznie, na szyi myszy umieszczono klips. Nagrania wykonano przez 10 do 20 minut. Podczas nagrywania niewielkie ruchy lub odnowienie szarpnięć często powodowało utratę sygnału lub błędu w jednym lub kilku parametrach. Do analiz wykorzystano tylko okresy czasu zawierające sygnał całkowicie pozbawiony błędów dla każdego mierzonego parametru. Dla każdej myszy zebrano co najmniej 6 różnych punktów czasowych trwających co najmniej 6 sekund przez co najmniej minutę danych, które później wykorzystano do analiz statystycznych. Pletyzmografia całego ciała. Czynność wentylacyjną oceniano za pomocą pletyzmografii całego ciała w warunkach nieskrępowanych (Buxco Research System). Krótko mówiąc, powietrze normoksyczne / normokapnikowe zastąpiono powietrzem hiperkapnii (CO2 5%) lub powietrzem niedotlenionym (O2 10%) przez 5 minut. Mierzyliśmy fR (w cyklu na minutę, c.minł.1), VT (. L) znormalizowano jako stosunek VT podzielony przez masę ciała (VT1g. 1), VE (ml.g. 1.min). 1), liczba bezdechów na minutę większa niż 2 zwykłe cykle oddechowe (bezdech> 2TOT) wyrażone jako wskaźnik bezdechu (AI) i IS (zmienność w czasie cykli oddechowych w ciągu 5 kolejnych okresów) (59). Pomiary przeprowadzono podczas (a) okresu kontrolnego pod powietrzem, przed prowokacją, (b) trzecią minutą prowokacji, (c) piątą minutą wyzwania, (d) okresem po ogłoszeniu (pierwsze 2 minuty po koniec wyzwania, kiedy normoksja lub normokapnia została przywrócona w komorze pletyzmograficznej) i (e) 10 do 15 minut później. Eksperymenty inaktywacji i ratowania analizowano jednocześnie; w związku z tym zastosowano te same kontrole (AAV-VNa CT), a wartości pokazano na obu wykresach. Dalsze szczegóły znajdują się w metodzie dodatkowej. Elektrofizjologia. Wszystkie eksperymenty wykorzystywały poprzeczne, rytmiczne plasterki rdzeniastego o wielkości 600- do 650 .m, uzyskane od 8 do 12-dniowych myszy NesKO, KO i kontrolnych. Myszy były głęboko znieczulane izofluranem (podawanym przez inhalację) i szybko zdekapitowane na poziomie kręgosłupa C3 / C4 (59). Pozakomórkowe zapisy uzyskano za pomocą szklanych elektrod ssących umieszczonych na powierzchni plastra w przedsionkowej grupie oddechowej (VRG) w pobliżu lub na górze preBötC. Wewnątrzkomórkowe nagrania patch-clamp uzyskano za pomocą wzmacniacza MultiClamp 700B (Molecular Devices), stosując technikę martwej łatki do neuronów VRG w preparatach z łodygami mózgu o długości od 600 do 650 .m. Dalsze szczegóły znajdują się w metodzie dodatkowej. Histologia Histologia została przeprowadzona zgodnie z opisem (23). Pokrótce, myszy znieczulono przedawkowaniem pentobarbitalu perfundowanym PBS, a następnie 4% PFA. Dalsze szczegóły znajdują się w metodzie dodatkowej. Statystyka. Dane są wyświetlane jako średnia. SEM. Do analiz statystycznych wykorzystano oprogramowanie GraphPad Prism v5.0. Odpowiednie testy zostały wybrane w zależności od projektu eksperymentalnego, jak podano w tekście. Istotność statystyczna, gdy została osiągnięta (P <0,05 uznano za znaczącą), jest podana w legendach tekstowych lub graficznych. Zatwierdzenie badania. Wszystkie eksperymenty na zwierzętach zostały zatwierdzone przez Komitet ds. Pielęgnacji i Użytkowania Zwierząt na Uniwersytecie w Waszyngtonie. Materiały uzupełniające Zobacz Dodatkowe dane Zobacz Dodatkowe wideo Podziękowania Ta praca została wsparta grantem od Mitochondrialnej Gildii NW (do RD Palmiter). A. Quintana był odbiorcą Ministerio de Ciencia e Innovación (Hiszpania) (MICINN) stypendium podoktorskie ds. Mobilności. Autorzy dziękują Jennifer Stone, Raj Kapur i Elisenda Sanz za pomoc w tych badaniach i Glenda Froelick za pomoc w histologii. Przypisy Konflikt interesów: Autorzy zadeklarowali brak konfliktu interesów. Informacje referencyjne: J Clin Invest. 2012; 122 (7): 2359-223. doi: 10,1172 / JCI62923. [hasła pokrewne: oriflame katalog 8 2015, reumatoidalne zapalenie stawów leczenie, katalog oriflame 2015 ]