szpitalna 5 tuszyn

Insuloma barwiona ujemnie na glukagon, marker. komórki i dla karboksypeptydazy-A (CPA), marker komórek zrazikowych (dodatkowa Figura 1B). W końcu bardzo rzadkie komórki insulinoma koeksprymowały insulinę i somatostatynę (Suplemental Rysunek 1B). Pozostała część insulinoma została zdysocjowana i wykorzystana do uzyskania człowieka. linia komórkowa, EndoC-P H2 (suplementowa figura 1C), z zastosowaniem wcześniej opisanych warunków hodowli (10). PCR przeprowadzony na genomowym DNA wskazał, że komórki EndoC-aH2 mają wbudowane zarówno transgenów SV40 LT, jak i hTERT (Suplemental Fig. 1D). Komórki EndoC-aH2 proliferowały z podwojeniem czasu od 5 do 7 dni. Badanie immunocytochemiczne wykazało, że komórki EndoC-a2 były pozytywne pod względem insuliny, peptydu C, CHGA, PDX1 i NKX6-1 (Figura 1B). Komórki były pozytywne pod względem SV40 LT i proliferowały, jak wskazano przez barwienie Ki67 (Figura 1B). Komórki barwione ujemnie na glukagon i obserwowano tylko rzadkie komórki wykazujące ekspresję somatostatyny (Figura 1B). Komórki EndoC-P2 barwiono ujemnie na CPA i amylazę, 2 markery groniaste i dla SOX9, markera przewodowego (Figura 1B). Wywołane za pośrednictwem komórki wycięcie immortalizujących transgenów znacznie zmniejsza proliferację komórek EndoC-a2. Transdukowaliśmy komórki EndoC-aH2 rosnącymi ilościami wektora lentiwirusowego (od 15 ng do 60 ng białka powierzchniowego p24 na 105 komórek) eksprymując Cre pod kontrolą wszechobecnego promotora CMV w celu zmiareczkowania ilości wektorem lentiwirusowym eksprymującym Cre. optymalna skuteczność transdukcji przy minimalnej ilości wektora lentiwirusowego (Suplementowa Figura 2A). Użyto odpowiedniego miana lentiwirusowego (15 ng białka kapsydu p24 na 105 komórek) do transdukcji komórek EndoC-aH2 z wektorem lentiwirusowym eksprymującym Cre. Jako kontrolę użyto 60 ng białka powierzchniowego p24 (najwyższe oznaczenie miana) wektora lentiwirusowego wykazującego ekspresję GFP. Komórki analizowano 21 dni po transdukcji. Na poziomie RNA, po transdukcji Cre poziomy SV40 LT zmniejszyły się o 92%, a egzogenna ekspresja hTERT została zmniejszona o 96% (Figura 2A). Tak gwałtowny spadek poziomów SV40 LT zaobserwowano również w immunocytochemii (Figura 2B). Ponadto, po transdukcji Cre poziomy mRNA Ki67 zmniejszyły się o 97%, co nie obserwowano, gdy komórki były transdukowane wektorem lentiwirusowym eksprymującym GFP (Figura 2C). Ten główny spadek ekspresji Ki67 był równoległy ze zmniejszeniem inkorporacji BrdU w komórkach wyrażających Cre. W szczególności, w ciągu 1-godzinnego okresu impulsowania, 14% niepransdukowanych komórek inkorporowało BrdU, podczas gdy 0,9% komórek transfekowanych Cre wprowadziło BrdU (Figura 2D). Warto zauważyć, że EndoC-P H2 skutecznie przeszedł procedurę usuwania za pośrednictwem wirusa. Konkretnie, przy 15 ng na 105 komórek wektora ekspresyjnego Cre, liczba komórek była zmniejszona o 7% w dniu 7. Ten poziom spadku był podobny do tego znalezionego, gdy komórki były transdukowane wektorem wyrażającym GFP. W dniach 14 i 21, zgodnie z oczekiwaniami,. liczba komórek wzrosła w komórkach transdukowanych wektorem ekspresjonującym GFP przy 60 ng białka powierzchniowego białka p24 (najwyższe badane stężenie), podczas gdy liczba komórek spadła bardzo wolno w komórkach transdukowanych 15 ng białka powierzchniowego p24 na 105 komórek wektora ekspresyjnego Cre (Spadek o 15,8% w dniu 14 i spadek o 21% w 21 dniu) (dodatkowa Figura 2B). Ryc. 2 Ocena unieśmiertelniania transgenów blokuje proliferację. Komórki EndoC-yH2 transdukowano wektorem lentiwirusowym eksprymującym Cre lub GFP i analizowano 21 dni później. (A) SV40 LT i ekspresję hTERT analizowano za pomocą RT-QPCR. Wyniki przedstawiono jako znormalizowane dla cyklofiliny i względem kontrolnych niepoddanych transdukcji komórek EndoC-aH2. Wyniki są wyświetlane jako średnie. SD 3 niezależnych preparatów RNA. Eksperyment powtórzono 2 razy. (B) Analiza immunofluorescencyjna SV40 LT (zielony) i insulina (czerwona) w nieściśniętych komórkach (. CRE) i wycięte komórki EndoC-aH2 (+ CRE)
[patrz też: punkty rubinowe, katalog oriflame 17 2014, pszczoła a osa ]