ul stojałowskiego 6 kraków

Długość Axona w 5-dniowych hodowlach neuronów rdzenia kręgowego z embrionów E12,5 została określona, jak podano wcześniej (40). Neurony korowe i komórki glejowe przygotowano ze zwierząt P0 lub P1 i hodowano jak opisano (41). Komórki utrwalono po 3 dniach w hodowli i wybarwiono pod kątem F-aktyny i wybarwiono immunologicznie przeciwciałami przeciw pofalowanym znacznikowi neurofilamentu SMI312. Obrazy neuronów uzyskano przy powiększeniu x 40 (Axioplan2; Zeiss), a długość aksonu mierzono za pomocą oprogramowania ImageJ. Analizy statystyczne przeprowadzono za pomocą testu Student. Frakcjonowanie podkomórkowe. Cztery myszy typu dzikiego zostały uśmiercone, a tkanki natychmiast usunięte i zamrożone w temperaturze. 80 ° C. Tkanki mielono przy użyciu wstępnie schłodzonego moździerza i tłuczka i homogenizowano za pomocą szklano-teflonowego urządzenia (Braun Biotech), jak opisano (34). Subkomórkowe frakcje otrzymano przez wirowanie różnicowe w 4 ° C (10 minut przy 1000 g do zarodków peletek, 15 minut przy 10 000 g do mitochondriów peletek, godzina przy 100 000 g, aby uzyskać grudkę frakcji błonowej). Frakcja postmitochondrialna była dalej frakcjonowana przez nieciągły gradient jodiksanolu, a poszczególne frakcje rozcieńczano, granulowano, rozdzielano w buforze próbek SDS (42) i ilościowo oceniano za pomocą immunoblottingu opartego na fluorescencji z zastosowaniem układu OIsis LI-COR. Oczyszczanie rekombinowanego REEP1. Sekwencję kodującą ludzkiego REEP1, w tym kodon stop, amplifikowano z cDNA uzyskanego z mózgu (Clontech) i wklonowano do wektora pET32-a (Novagen). Z tego konstruktu (HisTrx-REEP1) konstrukt dla wariantu HisTrx-REEP1-mut został wygenerowany przez mutagenezę Pośredniczoną przez PCR wprowadzeniem czterech pojedynczych zmian zasad (p.I57S, p.F58S, p.F62S i p.F64S) . Wyznakowane His białka fuzyjne oczyszczono z E. coli, jak opisano (35). Badanie hydrofobowe liposomu. Liposomy przygotowano zgodnie z opisem (43). Liposomy (150 .g) inkubowano z 0,5 .M białka przez 15 minut w 37 ° C w 0,3 M sacharozy w buforze liposomowym (25 mM HEPES-KOH, pH 7,2, 25 mM KCl, 2,5 mM Mg-octanu, 100 mM K -glutaminian) i zmieszane z 150 (ll 75% sacharozą w buforze liposomowym. Mieszaninę powleczono 200 .l 35% sacharozy i 200 .l buforu liposomowego, a następnie odwirowano przy 200 000 g przez 30 minut w 28 ° C. Sześć frakcji zawierających po 100 .l eluatu zbierano od góry do dołu i analizowano za pomocą SDS-PAGE i immunoblottingu. Obrazowanie na żywo mieszanin liposomów i białek. Liposomy uzupełniono 5% rodaminą PE (Avanti Polar Lipids), inkubowano z 0,1 (M M rekombinowanych białek w temperaturze pokojowej przez 10 minut i wizualizowano (Zeiss Observer Z1, Zeiss). Obrazy były pozyskiwane co 200 milisekund w okresie 2 minut. Badanie kształtowania liposomu. W doświadczeniach z liofilizacją mg liposomów inkubowano z 5. M białka w buforze liposomowym zawierającym 0,3 M sacharozy przez 15 minut w 37 ° C. Aby uniknąć agregatów liposomalnych, dodano następnie 20 .g proteinazy K, a następnie kolejną inkubację w 45 ° C przez 40 minut. Małe porcje (1. 2. L) zawiesiny pęcherzyków były zamrażane, jak opisano w opisie (41). Oznaczanie immunoglobulin w replikach typu freeze-fracture bez inkubacji z proteinazą K przeprowadzono przy użyciu swoistych przeciwciał pierwotnych anty-REEP1 (1:50), a następnie sprzężonego z drugorzędowym drugorzędowym przeciwciałem (1:50, 10 nm złota, British Biocell International). Próbki badano przy użyciu elektronowego mikroskopu elektronowego EM 902 A (Zeiss). Obrazy zostały pozyskane za pomocą kamery CCD 1k FastScan (TVIPS). Średnice 900 – 1300 struktur liposomowych na warunki inkubacji określono przy użyciu oprogramowania ImageJ. Statystyka. Jednokierunkową ANOVA użyto do porównań między trzema grupami (dla średnic liposomów i dla ultrastrukturalnej analizy struktur ER)
[patrz też: oriflame katalog 16 2015, rak szyjki macicy leczenie, katalog oriflame 3 2015 ]