zastosowanie baniek lekarskich

Kasetę opornościową neomycyny napędzaną promotorem PGK flankowaną przez miejsca loxP i poprzedzona miejscem EcoRI wstawiono do miejsca Smal w odległości 262 pz poniżej egzonu 2. Konstrukt elektroporowano do mysich komórek ES w R1. Klony oporne na neomycynę analizowano metodą Southern blotting DNA komórki ES z trawionym EcoRI. Prawidłowo ukierunkowane komórki ES transfekowano plazmidem eksprymującym rekombinazę Cre. Zdarzenia rekombinacyjne usuwające ekson 2, jak również kasety oporności na neomycynę zidentyfikowano po hybrydyzacji Southerna genomowego DNA strawionego EcoRI. Jeden z pozytywnych klonów wstrzyknięto do blastocyst C57BL6. Powstałe chimery następnie krzyżowano wstecznie z C57BL6 w celu otrzymania Reep1 + / y. myszy. Badania przeprowadzono z miotami z pokolenia F4. Genotypy określono metodą PCR na DNA wyizolowanym z biopsji ogona (Tabela dodatkowa 1). Przeciwciała. Surowice odpornościowe anty-REEP1 wytworzono przez immunizację królików przeciw peptydowi GRSSGKHSQPKMSRS (reszty 176. 190) (Eurogentech) i oczyszczono metodą powinowactwa jak opisano (34). Inne stosowane pierwotne przeciwciała to: królicze anty-aktyna (Abcam); mysz anty-TIM23 (BD Biosciences); króliczego anty-TUBB3 (a 3-tubulina, Sigma-Aldrich); mysi anty-adaptyna (Transdukcje BD); królicze przeciw reticulon-4 (Aviva Systems Biology); mysz anty-SMI312 (Hiss Diagnostics); mysz anty-NeuN (Millipore); królicze antyfosfo-tau (Biozol Diagnsotika); mysie anty-MAP2ab (Acris Antibodies); i hodowano królicze przeciwciała anty-HisTrx i oczyszczono metodą powinowactwa zgodnie z opisem (35). Analiza chodu. Kąt pod stopę w pozycjach palców tylnych łap oceniano ilościowo za pomocą pojedynczych klatek wideo z nagrań myszy poruszających się po promieniu (36). Analizy statystyczne przeprowadzono przy użyciu dwukierunkowej ANOVA. Wyzwaniem dla pieszych było nałożenie pochyłej drabiny (odległość między szczeblami: 2 cm, grubość szczebla: 2 mm, szerokość szczebla: 6 cm, nachylenie: 45 °) (37) i ocena jakościowa. Analiza histologiczna rdzenia kręgowego i mózgu. W analizie immunohistochemicznej kory ruchowej u 13-miesięcznych zwierząt Reep1 + / + i Reepp /, zwłoki komórek neuronalnych uwidoczniono przez barwienie NeuN krętków strzałkowych 20. M (n = 6 na genotyp) i oznaczono ilościowo warstwowo. W przypadku cięcia pół- i ultracienkiego zwierzęta perfundowano 50 ml utrwalacza (4% paraformaldehyd, 1% aldehyd glutarowy). Mózg i rdzeń kręgowy zostały usunięte i utrwalone na noc. Sekcje wieńcowe (150 .m) wycinano za pomocą wibratomu (Leica Microsystems) i przetwarzano jak opisano (38). Sekcje seryninowe zabarwiono błękitem metylenowym. Ultracienkie 80-nm sekcje (Ultratome III; LKB Instruments) zostały zamontowane na sfałdowanych miedzianych siatkach (100 mesh), ponownie wybarwione cytrynianem ołowiu i badane przy użyciu TEM (EM 900; Zeiss) przy 80 kV. Ilościowa analiza obrazów z mikroskopii elektronowej. W przypadku morfometrii wybrano tylko sekcje somatów z neuronów piramidowych, które nie wykraczały poza granicę obrazu i uderzano pionowo w stosunku do otoczki jądrowej. Pliki zostały przesłane za pomocą oprogramowania ImageJ (NIH), a granica komórek, jądro i pełny zestaw struktur ER podobnych do arkusza zostały wyśledzone dla każdej komórki za pomocą wrażliwego na dotyk ekranu z ekranem piórkowym. Sferyczność jądra obliczono jako obszar jądra podzielony przez pole koła w obrębie danego obwodu. Dane uzyskano dla czterech 12-miesięcznych zwierząt na genotyp i 12 neuronów na zwierzę. Analizy statystyczne przeprowadzono przy użyciu jednokierunkowej ANOVA. Analiza elektromograficzna. Wywołane amplitudy CMAP oceniono w opisany sposób (22). Analizy statystyczne przeprowadzono przy użyciu dwukierunkowej ANOVA. Hybrydyzacja in situ. Jako matrycę matrycową mysi fragment cDNA Reep1 amplifikowano i klonowano do pCRII-TOPO (Invitrogen). Radioaktywne (39) i nieradioaktywne (21) hybrydyzacje in situ przeprowadzono zgodnie z opisem. Analiza wzrostu aksonów i stresu ER w hodowlach neuronowych
[patrz też: oriflame katalog 8 2015, rak szyjki macicy leczenie, oriflame katalog 16 2015 ]